理学类细胞组分分析方法

2021-07-28 11:25:48

一、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法(组织化学和细胞化学法)

细胞化学技术:组织化学和细胞化学法、免疫细胞化学法

组织化学和细胞化学法的基本原理:利用--些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征,通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量,从而得以对某种成分进行研究和分析。

1.金属沉淀法:利用金属化合物在反应过程中生成有色沉淀,借以辨认所检查的物质或酶活性。如磷酸酶分解磷酸酯底物后,产生无色的磷酸铅,再与硫化胺反应最终生成CoS或PbS有色沉淀,而显示出酶

活性。(如酸性磷酸酶的显示)

2.Schiff反应:细胞中的醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。这种反应通常用于显示糖(PAS反应)和脱氧核糖核酸(Feulgen 反应)。

Feulgen Staining:1924年由Feulgen和Rossenback二学者发明,对DNA的反应具有高度的专一性。

原理: RNA被盐酸水解,DNA中的嘌呤被解离,从而使五碳糖的一-端 出现醛基,而醛基能使Schiff试剂中的无色品红反应,形成紫红色的带醌基的化合物。

3.联苯胺反应:过氧化酶分解H202。产生新生氧,后者再将无色的联苯胺氧化成联苯胺蓝,进而变成棕色化合物。

4.脂溶染色法:借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。

5.茚三酮反应:显示蛋白质。

二、细胞内特异核酸的定位与定性

分子杂交技术( molcular hybridization):是在研究DNA分子复性变化基础上发展起来的一种技术。

原理:具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段,在适当条件下,通过氢键结合,形成DNA-DNA,DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。

1.原位杂交(In situ hybridization):根据DNA分子复性的原理,在不破坏细胞与细胞器的情况下,采用核苷酸探针检测特定核苷酸序列在染色体的精确位置的技术,叫作原位杂交。

2.电镜水平的原位杂交技术:生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合。

3.印迹杂交(blot hybridization):用已知的带有标记的特定核酸分子(或抗体、蛋白质分子)作为探针,与通过印迹被转移的核酸分子(或抗原、蛋白质分子)片段杂交的过程。

4.Southern blotting (DNA印迹法):应用2P标记的DNA或RNA探针,与通过凝胶电泳分离并作了变形处理的DNA片段(已转移到了硝酸纤维素滤膜上)进行杂交来显示这些DNA。

5.RNA印迹术(Northern blotting):应用放射性标记的DNA探针与RNA分子(通常转移到了硝酸纤维素滤膜上)杂交来显示这些RNA分子的过程。

6.蛋白质印迹术( Western blotting):用来检测在不均一蛋白样品中是否存在目标蛋白的一种技术。蛋白质变性凝胶电泳分离转移到滤膜上,通过专一抗体探测目标蛋白,然后用一种标记的“二抗”检测在印记中存在的免疫复合物。